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应用分享 | SRRF-Stream+超分辨显微成像平台

发布日期:2021-02-28 00:00

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物理科学定律的局限性限制了科学知识的发现和科研工作的发展。直到21世纪初,光衍射极限定律都是显微成像领域牢不可破的障碍。这一物理定律可以这样描述,如果两个点的距离比用来观察他们的光波长的一半还要小,那么这两个点是不可分辨的。在具体的科研工作中,这意味着光学显微镜只能分辨200nm以上的物体/结构。由于许多亚细胞机构和细胞器都小于200nm,因此200nm的成像壁垒为科研的发展留下非常重要的知识空白。

 

21世纪的第一个十年里,一系列独创的显微成像技术打破了光的衍射极限定律。科学发展的一个新领域向科学家们打开了大门。多种超分辨显微成像技术包括STED(受激辐射损耗显微成像)STORM/PALM(随机光学重构显微成像/荧光光活化定位光学显微成像)以及SIM(结构光学显微成像)已经能够在生物样品中实现超过衍射极限的成像,帮助科研工作者们在众多科研领域开拓出新的科研成果。然而,已有的超分辨成像技术亦有没有办法避免的局限性。复杂的样品制备过程,长的成像时间以及高激发光能量的需求阻碍了这些技术在活细胞成像上的广泛应用。进一步的,光学需求和高性能计算机的需求使这些超分辨成像技术非常昂贵,阻碍了这些实验室的使用。

 

最近,转盘共聚焦成像技术结合光学过度采样和计算后重赋值的方法实现了超过衍射极限1.6倍的空间分辨率,并且非常适合活细胞成像,但是代价是减小成像视野,并且该系统常规共聚焦图像的分辨率较低,实现此种超分辨成像技术需要依靠价格昂贵的硬件设置。而AndorDragonfly转盘共聚焦依靠独创的针孔尺寸(25um40um)和孔间距组合提高了转盘共聚焦成像的轴向和横向分辨率,提供更高分辨率的常规共聚焦图像;进一步的,使用光子重赋值(去卷积)的方法,最终的轴向和横向分辨率可以达到240nm139nm

 

但是,如果科研工作者有更高分辨率的需求,或者没有转盘共聚焦显微系统的科研工作者如何才能获得高分辨率的图像呢?是否有可以代替的方法在全视野下实现高速、超分辨活细胞成像呢?Andor给出的答案是SRRF-Stream+(图1)。

 

1 共聚焦图像,共聚焦&去卷积和共聚焦&SRRF-Stream+的图像对比。更高放大倍数的图像更清楚的展示出成像分辨率。样品为使用PhalloidinmitotrackerDAPI染色的BPA细胞,使用DragonflyiXon 888相机在共聚焦模式(无SRRF)和共聚焦&SRRF-Stream+拍摄而成。

 

2016年,Henriques实验室发展了针对超分辨成像技术的替代技术,命名为SRRF-Super-Resolution Radial Fluctuations (1). SRRF可以在宽场、共聚焦、TIRF等光学显微成像系统中使用,最终的成像分辨率依靠成像数据的特性。依靠于SRRF算法,在XY方向的最高分辨率为50nmSRRF算法不需要特殊的样品制备过程,也不需要特殊的荧光染料,兼容各种传统的荧光染料和荧光蛋白。

 

更重要的是,超分辨SRRF图像的成像速度在20-100fps之间(更多幅的图像计算获得更高分辨率的图像,降低了成像时间分辨率),使用的激发光能量仅仅在mW~W/cm2,使SRRF非常适合活细胞成像(1,2)。为了获得SRRF图像,需要长时间采集的工作流程,SRRF超分辨图像通过ImageJ的插件-NanoJ后处理获得。


 


2 SRRFSRRF-Stream算法的成像分辨率随着单位时间点采集帧数的增加而提高。A)成像分辨率随着采集帧数的增加而增加。图像清楚的表明,成像分辨率在计算帧数为100时有了明显的提高,Mean表示所有的径向波动平均值相关分析(在不同的ROI),minimus为特定ROI内可以达到的最大分辨率。B1B2Andor Dragonfly高速共聚焦系统TIRF模式下的细胞微丝图像(B1)及TIRFSRRF-Stream处理后的图像(B2),图像清楚的显示在TIRF工作模式下,SRRF-Stream图像分辨率有了明显的提高。

 

基于AndorHenriques教授的良好合作,基于SRRF算法,Andor2018年推出了SRRF-Stream,通过一键操作获取超分辨图像。与原始SRRF算法相比,SRRF-Stream的分辨率随着采集帧数的增加而提高, 达到100帧时,成像分辨率有显著的提高,图像数据从100增加到500时,成像分辨率稳步提高,在高于500帧时,成像分辨率提高的比较少。需要指出的是,其他的参数例如曝光时间、Nyquist采样、径向放大倍数以及增加计算半径都会影响成像的分辨率,在具体计算时,应该进行多次设置以获得最优的成像结果。

 

3 单位时间点下的SRRF-Stream分辨率随着采集帧数的增加而增加,样品为100nm tetraspeck荧光微球,测量其FWHM(半高宽,Full Width at Half Maximum),实验结果表明,将SRRF-Stream的计算帧数设置成100帧,可以测量出荧光微球的FWHM100nm,这表明SRRF-Stream可以分辨100nm的荧光微球。图像在共聚焦模式及不同SRRF-Stream帧数下获得:100, 200, 500, 700, 1000。非常感谢爱丁堡大学基因与分子医学研究所先进成像平台主管Ann Wheeler博士。

 

AndorSRRF-Stream具备活细胞超分辨成像,以及原理玻片的细胞及组织内部超分辨成像,将超分辨成像技术往前推进了一大步。

 

目前,SRRF-Stream可以在AndoriXon EMCCD和背照式sCMOS Sona系列相机上实现,通过micro-managerDragonfly共聚焦的控制软件fusion进行操作。SRRF-Stream的优点主要有(3,4)

 

  • 实时超分辨成像,不需要图像后处理,提高工作效率;
  • 将成像分辨率提高2~6倍,最终的成像分辨率为50~150nm,成像分辨率与成像模式(宽场、共聚焦、TIRF)和实验条件相关;
  • 成像时激发光的功率低(mW~W/cm2),非常适合于活细胞的成像,最小化影响细胞的生理过程;
  • 兼容各种传统的荧光染料和荧光蛋白;
  • 样品制备简单。

 

SRRF-Stream在各种显微成像系统下都能实现超分辨功能,与各种成像模式宽场、TIRF、共聚焦成像相互兼容。

4 不同程序模式(宽场与共聚焦)下有无SRRF-Stream+的图像比较,样品为Hela细胞,分别标记了MLKP1(红色),a-tubulin(绿色微管)和DAPI(蓝色DNA),成像系统为配备iXonDragonfly共聚焦系统。

 

20207月,Andor发布了SRRF算法的高级版本:SRRF-Stream+,图1,4,5,6,7

 

SRRF-Stream+通过增加径向计算使SRRF算法更往前一步,与最初版本的SRRF相比,径向计算参数从之前的6个增加到现在的24个,进一步提高了超分辨图像处理流程,移除了上个版本中偶然出现的星状假象,这类假象在处理类似着丝点这样的圆状结构中经常出现。

 

5 SRRF-StreamSRRF-Stream+的径向测量值,与上一版本相比,SRRF-Stream+通过增加径向计算测量值获得更准确的SRRF图像。

 

为了获得最好的SRRF-Stream+效果,拍摄图片时必须满足Nyquist采样定律。与之前报道的一样,采样参数大于2.3时,能够获得最好的成像分辨率,然而采样参数在1.5左右时,基于SRRF-Stream+也能获得较好的成像结果。

 

6 SRRF-Stream+算法带来高质量的超分辨成像,样品为使用PhalloidinmitotrackerDAPI染色的BPA细胞,使用DragonflyiXon 888相机在共聚焦&SRRF-Stream+拍摄而成。

 

在分析图1,4,5,7的图像时,SRRF-Stream+带来分辨率上的提升是明显的。但是仍然有些潜在的客户会问到:SRRF-Stream+的成像速度怎么样?SRRF-Stream+径向测量参数由6提高到24,是不是成像速度也下降了四倍?在研发新的SRRF算法的过程中,Andor也认为采集速度对于科研工作者来说也是一个非常重要的参数。在提高图像质量的同时对成像速度带来最小的影响是共同的追求。为了完成这个目标,Andor采用NVIDIAGPU显卡的大数据计算能力实现对SRRF-Stream+计算的加速。在采集100个时间点的序列超分辨图像时,间隔时间仅仅为0.5s,其中单个时间点的SRRF-Stream+图像由50个图像计算得到[2]

7 SRRF-Stream+带来高质量的图像数据。在较高的放大倍数下,类着丝点样品出现的伪星状结构,SRRF-Stream+通过计算24个方向上的径向测量值消除了这种星状缺陷。样品为Hela细胞,使用KinetochoreCenp-A(绿色),DAPIDNA(蓝色)染色,成像系统为配备了iXon 888 Dragonfly系统。

 

AndorSRRF-Stream+保持了原有SRRF-Stream的优点,并且在图像质量上也有明显的提升。超分辨图像处理程序依然要比ImageJ SRRF30多倍,SRRF超分辨图像的采集/处理是同步进行的,并且与显微系统的数据采集并行工作。SRRF-Stream+算法获得的图像最终分辨率在50~150nm之间,加上其低激发能量的需求,因此SRRF-Stream+特别适合活细胞成像; 并且可以在整个成像视野中获取超分辨图像,成像深度并不再仅仅局限于细胞表面;SRRF-Stream+在不需要特殊样品制备的情况下实现对细胞和组织深处的样品的超分辨图像

 

SRRF-Stream+的发布扩展了SRRF-Stream应用范围。使用iXon EMCCD SRRF-Stream应用有: 通过微管的扰动,追踪分析线粒体在细胞内的运动动力学(5),间充质干细胞中HlF1a的核转位分析(3)。Dragonfly多模态共聚焦成像系统亦可以采集SRRF-Stream图像,具体的案例有:使用光遗传学的方法分析细胞分裂(7),囊泡运输研究,分析II PI3Ks网格蛋白介导的胞饮作用中的调控作用(8)。SRRF-Stream+的其他应用包括亚细胞器水平上的蛋白结构分析,细胞内单分子的追踪,单个SNARE蛋白机器的膜融合研究,细胞骨架的重组装等。

 

上述成功的应用案例表明SRRF-Stream+算法完全能够满足活细胞超分辨科学研究工作的需求,为了进一步扩大SRRF-Stream+的应用范围,Andor公司日前宣布Andor背照式sCMOS系列相机也能够支持SRRF-Stream+的超分辨显微成像的计算。

 

[1] For more detailed information on how to sample on Ixon cameras please go to Andor original  SRRF-Stream tech note.

[2] Full field of view (1024 X1024) images acquired with iXon Ultra.

 


 

Sona系列相机和iXon系列相机在性能方面的差异

 

iXon EMCCD具备超高灵敏度的特性,非常适合特定采集帧频下较弱荧光信号的图像;Sona系列相机更小像素尺寸的特性在较低放大倍数的物镜下满足Nyquist采样定律,例如在60倍物镜下,Sona系列相机采集图像的分辨率和图像质量显著高于相同条件下iXon采集到的图像。

 

SRRF-Stream+采集图像质量由多个参数决定,需要结合相机类型、成像系统、成像模式和样品的类型具体测试和分析。表1中给出了iXonSona系列相机与不同光学放大系统的组合对系统采样系数的影响。由表1里面的计算数据看出,由于sCMOS的像素尺寸普遍较小,在倍数较低的(60倍)的物镜下也能够满足Nyquist采样定律,实现高分辨图像的采集。

 

 

相机

类型

像素尺寸(um)

物镜

倍数

NA

光学放大

相机上的分辨率(um) 

Nyquist采样系数

物镜分辨率(nml=600nm

iXon 897

 

16

100

1.49

1

24.56

1.5

245.64

100

1.49

1.5

36.85

2.3

245.64

60

1.40

1.5

23.53

1.5

261.43

60

1.40

2

31.37

2.0

261.43



iXon 888

 

13

100

1.49

1

24.56

1.9

245.64

100

1.49

1.5

36.85

2.8

245.64

60

1.40

1.5

23.53

1.8

261.43

60

1.40

2

31.37

2.4

261.43

 

Sona 4.2-11

 

11

100

1.49

1

24.56

2.23

245.64

100

1.49

1.5

36.85

3.35

245.64

60

1.40

1.5

23.53

2.14

261.43

60

1.40

2

31.37

2.85

261.43



Sona 4.2-6

6.5

100

1.49

1

24.56

3.78

261.43

60

1.4

1

15.69

2.41

261.43

60

1.4

1.5

23.53

3.62

261.43

 

1物镜与光学放大的不同组合导致了系统采样系数的不同

 

8典型生物样品的宽场图像与SRRF-Stream+高分辨图像的对比图

A:为心肌细胞中肌间线蛋白比较,采用Zeiss宽场显微镜、60倍物镜的拍摄条件,相机为Sona4.2B-6 sCMOS,非常感谢美国宾夕法尼亚大学Prosser教授课题组的Matt Caporizzo

B:为BPAE细胞的F-Actin图像比较,采用Nikon Ti2宽场显微镜、60倍物镜的拍摄条件,相机为Sona4.2B-11 sCMOS,非常感谢日本北海道大学的Motosuke Tsutsumi

 

8展示了基于Sona sCMOS系列相机的SRRF-Stream+算法典型生物样品上图像,可以看出在比较典型的宽场成像模式下,SRRF-Stream+算法获得图像信噪比和分辨率都有了显著的提高。

 

总结,我们进一步提高了SRRF-Stream算法,使其更适合活细胞超分辨科学研究。SRRF-Stream+的超分辨图像移除了成像伪结构,补偿了相机的固定噪声,给科研工作提供更高质量的超分辨图像。背照式sCMOS相机SRRF-Stream+加入扩展了应用范围,使用较低倍数的物镜也能够获得较高质量的高分辨成像数据。欢迎大家联系我们,获得有关SRRF-Stream+的更多信息。

 

 

参考文献:

 

  1. Gustafsson, N., Culley, S., Ashdown, G. et alFast live-cell conventional fluorophore nanoscopy with ImageJ through super-resolution radial fluctuations. Nat Commun 7, 12471 (2016).

https://doi.org/10.1038/ncomms12471

  1. Culley S, Tosheva KL, Matos Pereira P, Henriques R. SRRF: Universal live-cell super-resolution microscopy. Int J Biochem Cell Biol. 101:74-79(2018).

https://doi:10.1016/j.biocel.2018.05.014

  1. Browne M. Twelve Reasons Why Your Next Confocal Should Be Dragonfly.(2017)

https://www.oxinst.com/assets/uploads/downloads/Dragonfly-Twelve-Reasons-Why.pdf

  1. Coates C, ‘SRRF-Stream’: Real-Time Super-Resolution in a Camera.(2017)

https://andor.oxinst.com/assets/uploads/documents/srrf-stream-technical-note.pdf

  1. Choi, G.E., Oh, J.Y., Lee, H.J. et al. Glucocorticoid-mediated ERmitochondria contacts reduce AMPA receptor and mitochondria trafficking into cell terminus via microtubule destabilisation. Cell Death Dis 91137 (2018).

https://doi.org/10.1038/s41419-018-1172-y

  1. Lee, H.J., Jung, Y.H., Oh, J.Y. et al. BICD1 mediates HIF1α nuclear translocation in mesenchymal stem cells during hypoxia adaptation.Cell Death Differ 261716–1734 (2019).

https://doi.org/10.1038/s41418-018-0241-1

  1. Castillo-Badillo J.A., Bandi A. C., Harlalka, and Gautam N. SRRF-Stream Imaging of Optogenetically Controlled Furrow Formation Shows Localised and Coordinated Endocytosis and Exocytosis Mediating Membrane Remodeling. ACS Synth. Biol. 9, 4, 902–919(2020).

https://doi.org/10.1021/acssynbio.9b00521

  1. Aung, K.T., Yoshioka, K., Aki, S. et alThe class II phosphoinositide 3-kinases PI3K-C2α and PI3K-C2β differentially regulate clathrin-dependent pinocytosis in human vascular endothelial cellsJ Physiol Sci 69263–280 (2019)

https://doi.org/10.1007/s12576-018-0644-2.

 

 

 

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